应用细菌同源重组法快速构建和制备重组腺病毒 - 百度文库

来自 : 发布时间：2024-12-23

[收稿日期]2002-01-29[修回日期]2002-05-22*[基金项目]国家杰出青年科学基金资助项目(No.39925014);国家自然科学基金资助项目(No.30030060;39870332;39800074)#联系人:Tel:020-85148231;E-mail:yjiang@public. gd.cn [文章编号]1000-4718(2002)11-1451-04 #实验技术# 应用细菌同源重组法快速构建和制备重组腺病毒 * 李红乐1,2,秦清和1,王静珍1,邓鹏1,李树浓2,姜勇1# ( 1 第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室,广东广州510515; 2 中山大学中山医学院病理生理学教研室,广东广州510080) [摘要]目的:利用大肠杆菌细菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度重组病毒。方法:自细胞周期相关激酶真核表达载体pCR311-CCRK中酶切出CCRK基因,亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-CCRK,采用电穿孔或化学转化法在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd-CCRK。以pAd-CCRK为模板,经DNA测序正确后,用PacI酶切线性化pAd-CCRK,转染293细胞,包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察转染细胞EGFP的表达,采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定。将重组病毒上清感染RAW细胞,荧光显微镜下观察感染细胞重组病毒的表达。结果:成功地构建了携带CCRK基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒,重组病毒能在体外高效表达。结论:应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体,可高效制备均一的高滴度重组病毒,为CCRK基因功能的研究奠定了基础。[关键词]腺病毒;同源重组;荧光蛋白 [KEYWORDS]Adenoviruses;Homologousrecombination;Fluorescentprotein[中图分类号]Q78[文献标识码]B 后基因组时代更强调对基因功能的研究,因而 选择高效的载体介导其体内外转移变得更加重要。重组腺病毒载体具有转染效率高,感染细胞范围广,病毒滴度高,可感染细胞周期中静止期和分裂期细胞,同时可高效介导基因的体内外转移。新近,构建携带外源基因的重组腺病毒载体不仅用于遗传病和肿瘤的疾病基因治疗,也开始越来越多的用于基因功能的研究[1] 。我们利用细菌内同源重组系统快速高效地构建了携带外源基因细胞周期相关激酶(cellcyclerelatedkinase,CCRK)的重组病毒载体,利用在同源重组时整合入重组病毒质粒中的增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)表达盒直接在荧光显微镜下观察转染的效率,大大加速了重组腺病毒载体的构建、重组腺病毒的制备、滴度测定和纯化过程,为相关基因的功能研究奠定了基础。 材料和方法 1试剂 各种限制性内切酶、T4连接酶和碱性磷酸酶分别为Takara公司和NewEnglandBiolab公司产品。质 粒提取试剂盒为QIAGEN公司产品。电穿孔仪为 Westburg公司ECM830电穿孔仪。其它试剂均为进口或国产分析纯。2菌株、质粒和细胞株细菌同源重组系统包括大肠杆菌BJ5183、DH10B、穿梭质粒pAdTrack-CMV、腺病毒骨架质粒pAdEasy-1购自Strategene公司,DH5A菌为本室保存。携带CCRK基因的真核细胞表达载体由本室构 建。293细胞引自ATCC,RAW-26417细胞株为本室保存。 3实验技术路线 如图1示。 4将CCRK基因亚克隆入穿梭载体 pCR311-CCRK质粒经KpnI和XbaI双酶切出113kb的目的基因,1%的琼脂糖凝胶电泳,glassmilk法凝胶回收目的片段,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成pAdTrack-CCRK。 5细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒 取1LgpAdTrack-CCRK用PmeI线性化后,1%的琼脂糖凝胶电泳,凝胶回收目的片段,用牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化,乙醇沉淀备用。分别采用两种方法进行细菌内同源重组。 511电穿孔法制备BJ5183电穿孔菌;取011Lg超螺旋的pAdEasy-1质粒与1Lg的线性化pAdTrack- # 1451#中国病理生理杂志ChineseJournalofPathophysiology2002,18(11):1451-1454